El ensayo ELISpot
Análisis funcional de la inmunología celular
En condiciones de funcionamiento óptimo, el ensayo de detección basado en la inmunoabsorción ligada a enzima (ELISpot) permite la visualización de varios productos secretados a partir de una sola célula respondedora. Por lo tanto, ELISpot ofrece información cualitativa (el tipo de proteína secretora) y cuantitativa (el número de células reactivas). Gracias a la exquisita sensibilidad de este ensayo, el análisis de poblaciones celulares poco frecuentes (por ejemplo, respuestas a antígenos específicos) que antes no era posible, ahora es relativamente fácil. Las mejoras recientes en el diseño de microplacas de varios pocillos, incluido el uso de membranas con baja señal de fluorescencia de fondo, han reforzado la extensa aplicación de ensayos EliSpot.
Cuando se tienen en cuenta la sensibilidad del ensayo, la facilidad de uso y los costes, la plataforma EliSpot es, probablemente, la mejor elección para el desarrollo de los ensayos de células T multifuncionales para investigación, terapia y diagnóstico.
Optimización de ELISpot
Mientras que los ensayos ELISpot permiten la determinación de la frecuencia de eventos muy raros, la interpretación de datos puede llegar a ser ambigua cuando los números de detección en los pocillos que contienen antígenos son bajos, los recuentos de detección en los pocillos de controles negativos son altos y, especialmente, cuando ambas cosas ocurren al mismo tiempo. Por lo tanto, la tarea principal, incluso antes de que se empleen las estadísticas, debe ser la optimización de los parámetros y los reactivos básicos del ensayo para maximizar la relación señal-ruido. Mientras que el uso de pares de anticuerpos específicos validados para ELISpot es clave para el éxito del ensayo, se necesitan una consideración y una ejecución adecuadas de varios pasos más para garantizar un rendimiento óptimo.
La popularidad de este ensayo ha visto un resurgir en los últimos años, en los que los investigadores están intentando comprender mejor las respuestas inmunitarias en diversas aplicaciones, incluido el estudio de la memoria inmunológica y el desarrollo de vacunas.
Elección de microplaca (membrana)
Se recomiendan las placas de membrana de PVDF (catálogo de Merck, n.º MSIPS4W10, MSIPS4510, MAIPSWU10, MAIPS4510), sobre un formato de éster y celulosa mixta (catálogo de Merck, n.º MSHAS4510), debido a la unión ligeramente mejorada de anticuerpos capturados y a un rendimiento superior en la detección, especialmente para aplicaciones fluorescentes. El único inconveniente de las placas de PVDF es la extrema hidrofobia del material, una propiedad que puede requerir una humidificación previa con alcohol, antes de añadir el recubrimiento de anticuerpo. Puesto que la membrana de celulosa mixta es hidrófila, ELISpot puede ejecutarse sin humidificación previa.
Controles negativos/positivos
Los controles relevantes son cruciales para medir las respuestas específicas de antígenos mediante ELISpot. Los controles negativos consisten de forma rutinaria en cultivos celulares sin estímulos, mientras que los activadores de células T policlonales se usan comúnmente como controles positivos para confirmar tanto la funcionalidad celular como la del ensayo. Los controles positivos incluyen anticuerpos anti-CD3/CD28, fitohemaglutinina (PHA) y concanavalina A (ConA). Estos activadores inducen la secreción de muchas citoquinas, entre otras, IFNγ, IL-2 (Th1), IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (Th2).
Otro control común son los conjuntos de péptidos CEF (citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la gripe) disponibles en el mercado. Estos consisten en varios epítopos de cada uno de los tres virus, para los que la mayoría de individuos sanos (~90 %) posee células T que responden ante CD8.
Como solo podemos resumir algunos aspectos en este artículo, nos gustaría referirle a nuestro ELISpot White Paper (Documento técnico de ELISpot) donde se trata el protocolo del ensayo en detalle, destacando las prácticas recomendadas estándar y las guías de solución de problemas.
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