Retos del ADN plasmídico utilizado en aplicaciones biofarmacéuticas y terapia génica
Introducción
La demanda de ADN plasmídico ultrapuro y de alta calidad ha aumentado enormemente en respuesta a los rápidos avances en su uso. Nuevas aplicaciones, como el desarrollo de vacunas basadas en ARNm, la producción de anticuerpos y la terapia génica mediante vectores virales, requieren ADN plasmídico como un importante material de partida. Un aspecto especialmente difícil de estos procedimientos es la presencia de endotoxinas, que se sabe que son contaminantes frecuentes en el ADN plasmídico extraído de bacterias. Aunque muchas aplicaciones típicas posteriores, como la secuenciación y la clonación, no se ven afectadas por la presencia de estas moléculas, las endotoxinas son motivo de gran preocupación en las aplicaciones biofarmacéuticas y de terapia génica.
¿Cuáles son los efectos biológicos de las endotoxinas?
Las endotoxinas son lipopolisacáridos localizados en la membrana externa de las bacterias Gram negativas. In vivo, las endotoxinas se unen a los receptores de la superficie de las células inmunitarias y las estimulan para que secreten citocinas proinflamatorias (por ejemplo, factores de necrosis tumoral y factores activadores de plaquetas) e induzcan la producción de mediadores de la inflamación como la interleucina (IL)-1 y la IL-6. Cuando los niveles de endotoxina superan la capacidad del sistema inmunitario, éste puede reaccionar de forma exagerada e inducir una respuesta inmunitaria excesiva que incluye fiebre alta y, en el peor de los casos, shock séptico y muerte por fallo orgánico. Los niveles más bajos de endotoxinas también provocan numerosos efectos biológicos, como fiebre, alteración de la resistencia a la infección bacteriana y leucopenia seguida de leucocitosis.
La intensidad de esta respuesta inmunitaria demuestra la necesidad de ADN plasmídico libre de endotoxinas para las aplicaciones en terapia génica. Sin embargo, la terapia génica no es la única aplicación posterior afectada por la presencia de endotoxinas en el ADN plasmídico. También se ha descrito que las endotoxinas tienen diversos efectos en los cultivos celulares, como el aumento de la citotoxicidad y la alteración del crecimiento celular, la diferenciación y la producción de proteínas. Las células sensibles responden fuertemente incluso a concentraciones muy bajas de endotoxinas en el ADN plasmídico, lo que provoca una reducción significativa de la eficacia de transfección o falsos resultados en los análisis de expresión génica. En general, la presencia de endotoxinas en el ADN plasmídico resulta ser una variable no controlable, por lo que la interpretación fiable de los datos y la reproducibilidad de los resultados exigen su eliminación.
¿Cómo elegir el producto adecuado para la eliminación de endotoxinas?
El nivel de contaminación por endotoxinas encontrado en el ADN plasmídico depende en gran medida del método de purificación utilizado. Aunque probablemente no exista la ausencia total de endotoxinas, existe un acuerdo general para considerar que el ADN purificado (con valores inferiores a 0,1EU/μg de ADN) está libre de endotoxinas (EF). La tecnología de última generación utilizada para conseguir purezas tan elevadas dentro de un sistema de purificación de plásmidos cómodo (partiendo de células bacterianas) se basa en la cromatografía de intercambio aniónico y requiere sistemas tampón especiales patentados.
¿Por qué elegir Macherey-Nagel™ para estas aplicaciones de ADN plasmídico?
Desde el desarrollo del aislamiento de plásmidos basado en kits hace más de 35 años, Macherey-Nagel™ ha sido pionero en soluciones rápidas y altamente fiables para la purificación de ADN plasmídico. Los kits NucleoBond™ Xtra EF de Macherey-Nagel™ combinan un excelente método de cromatografía de intercambio aniónico con un sistema tampón rápido y eficaz para la eliminación de endotoxinas. Aprovechan una tecnología patentada que enmascara las endotoxinas e impide que se unan a la matriz de intercambio aniónico. Este procedimiento es muy eficaz y cómodo, ya que los aditivos se suministran en tampones listos para usar y se evitan pasos de incubación adicionales. Estos kits NucleoBond™ EF producen concentraciones de endotoxinas tan bajas como 0,01-0,1EU/μg de ADN, muy por debajo del umbral EF. El ADN plasmídico EF resultante es adecuado incluso para aplicaciones difíciles y proporciona la mayor pureza posible.
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