Invitrogen™ Click-iT™ Plus TUNEL Assay Kits for In Situ Apoptosis Detection

Los ensayos Click-iT Plus TUNEL Alexa Fluor 488, 594 y 647 para la detección de apoptosis in situ pueden detectar células apoptóticas en muestras de tejidos y células cultivadas mediante la incorporación de una pequeña fracción de etiquetado altamente específica y un colorante fluorescente brillante. Tras la incorporación de la fracción de etiquetado en los fragmentos de ADN, la detección se logra mediante una reacción de «clic» catalizada utilizando condiciones lo suficientemente leves como para preservar la señal fluorescente emitida de la GFP (proteína verde fluorescente) o RFP (proteína roja fluorescente).

Otras ventajas del ensayo Click-iT Plus TUNEL para detección de apoptosis in situ incluyen:
• Optimizado para la detección de células apoptóticas en muestras de tejido o células.
• El multiplexing permite trabajar de manera óptima con colorantes fluorescentes o proteínas como la GFP y RFP.
• Ensayo TUNEL mejorado: mejor incorporación de etiquetas debido a una pequeña fracción reactiva.
• Señal apoptótica brillante: usa coloraciones Alexa Fluor, las cuales provocan una señal fluorescente estable y sin decoloración fotográfica.
• Flexibilidad: el ensayo se puede configurar para probar de una a 50 muestras a la vez.

La fragmentación del ADN celular es un sello distintivo de la apoptosis. El ensayo TUNEL es el método más utilizado para detectar ADN fragmentado en células apoptóticas o muestras de tejido. El ensayo TUNEL comienza con la incorporación de dUTP (2'-desoxiuridina 5'-trifosfato) modificado en el extremo 3'-OH del ADN fragmentado. La modificación de dUTP suele ser la adición de un fluoróforo. Debido al tamaño del fluoróforo, la dUTP modificada puede mostrar unas tasas de incorporación inferiores a las esperadas, lo que puede afectar a la sensibilidad del ensayo TUNEL. Además, muchos de los fluoróforos utilizados en kits de ensayo TUNEL disponibles actualmente sufren de decoloración fotográfica y problemas de solapación espectral fluorescente, que reducen la sensibilidad y la capacidad de multiplex del ensayo.

El ensayo Click-iT Plus TUNEL ha sido desarrollado para dar respuesta a estas cuestiones. El ensayo utiliza dUTP modificada con un grupo alquino (un pequeño grupo funcional bioortogonal) que permite que el nucleótido se incorpore con más facilidad. Tras su incorporación, una reacción de clic muy específica entre el grupo alquino y un colorante fluorescente de azida picolil Alexa Fluor y la detección posterior de ese colorante, se obtiene como resultado un ensayo sensible y específico para la detección de células apoptóticas o muestras de tejido. A causa de sus condiciones de reacción suaves, el ensayo Click-iT Plus TUNEL permite el multiplexing con colorantes o proteínas fluorescentes.

El ensayo Click-iT Plus TUNEL ha sido validado con varios tipos de tejidos fijados en formol incluidos en parafina. En todos los casos se conservó su capacidad de multiplexar con colorantes y proteínas fluorescentes. Además, se conservó la habilidad para la tinción de actina mediante faloidina etiquetada fluorescente.

El ensayo Click-iT Plus TUNEL contiene todos los reactivos necesarios para detectar células apoptóticas desde cualquier muestra de tejido o células. Los reactivos suministrados en este kit se pueden usar para probar 50 muestras y se pueden configurar para probar de una a 50 muestras a la vez.