Invitrogen™ Flp-In™ T-REx™ Core Kit

• Una vez que se haya creado la línea celulares anfitrionas Flp-InT-REx que contiene el sitio FRT integrado, la generación subsiguiente de líneas celulares Flp-InT-REx que expresan genes de interés es rápida y eficiente.
• Permite la generación de líneas celulares estables isogénicas e inducibles.
• Permite la selección policlonal de líneas celulares de expresión estables.
• Para generar la línea celular anfitriona Flp-InT-REx para la expresión génica, primero se transfectará secuencialmente la línea celular de mamíferos con pFRT/lacZeo y pcDNA6/TR, que se integran de forma aleatoria e independiente en el genoma anfitrión.
• El anterior contiene el sitio FRT (para la recombinación intermolecular homóloga) secuencia abajo del codón de inicio de la fusión lacZ-Zeocin.
• Este último expresa constitutivamente el represor de tetraciclina, que permitirá regular la actividad del promotor TetO₂.
• El siguiente paso en la generación de una línea celulares inducibles es cotransfeccionar los vectores pOG44 y pcDNA5/FRT/TO (este último contiene un gen de interés bajo el control de CMV regulado por tetraciclina/promotor TetO₂) a la línea celular anfitriona.
• La recombinación homóloga entre los sitios FRT en pcDNA5/FRT/TO y en el cromosoma de la célula anfitrión, catalizada por la recombinasa Flp expresada a partir de pOG44, genera líneas celulares derivadas en las que el gen se ha integrado de forma estable en el cromosoma de la célula anfitrión.
• Estas células se pueden seleccionar y mantener mediante la resistencia de higromicina y blasticidina adquirida como consecuencia del evento de recombinación.

Expresión de mamíferos, expresión de proteínas, proteínas, expresión, aislamiento y análisis, expresión regulada, integración dirigida