Invitrogen™ P450 Demethylation Fluorescent Activity Kit

El kit de la actividad de la demetilasa P450 (para uso exclusivo en investigación) es un ensayo de actividad fluorescente y está diseñado para la detección y cuantificación de la actividad de la desmetilación P450 en microsomas hepáticos o cerosomas como CYP P450 3A4, 2B4 y 2D6.

Este kit incluye placas negras de 96 pocillos, tampón de ensayo, estándar de formaldehído y otros componentes para realizar el ensayo. Este kit no contiene sistemas de P450. El usuario debe suministrar los sistemas de microsomas, cerosomas, baculosomas o supersomas P450, o el recombinante P450. Para utilizar este kit se necesita un lector de microplacas de fluorescencia de 96 pocillos capaz de leer emisiones fluorescentes a 510 nm, con excitación a 450 nm.

Características de rendimiento
• Tipo de ensayo: kit de actividad fluorescente
• Tipos de muestras: sistemas P450 de desmetilación como los microsomas hepáticos o los cerosomas, como CYP P450 3A4, 2B4 y 2D6
• Intervalo de curva estándar: 1,6–20 pmol/100 μl
• Reactividad: humano, rata

Antecedentes
Los citocromos P450 (P450s) son una superfamilia de enzimas que contienen hemo, que presentan una gran diversidad en cuanto a la especificidad del sustrato y la actividad catalítica. Los P450s utilizan una amplia variedad de compuestos exógenos y endógenos como sustratos en las reacciones enzimáticas. Por lo general, forman parte de las reacciones de transferencia de electrones multicomponentes. La catálisis de las enzimas P450 de las eucariotas implica un ciclo de reacción de varios pasos que incluye dos pasos en los que la transferencia de electrones se realiza desde un elemento redox compañero. La proteína de la diflavina, la NADPH del citocromo P450 reductasa, contiene tanto FAD como FMN y puede transferir los electrones necesarios para el ciclo catalítico3. En algunas reacciones del P450, el citocromo b5 también puede suministrar el segundo electrón para el ciclo de reacción.

El lípido desempeña un papel importante en la reconstitución de las actividades dependientes del P450 después de la purificación de la proteína6. La mayoría de los estudios in vitro para la reconstitución de las actividades del P450 utilizan la dilaurilfosfatidilcolina (DLPC) como componente lipídico. La reconstitución de la actividad enzimática implica una incubación concentrada de P450, los elementos redox compañeros (NADPH y reductasa) y los lípidos, seguidos de una dilución en los componentes finales del ensayo.

Principio del ensayo
El kit de actividad de la demetilasa P450 está diseñado para medir cuantitativamente la actividad enzimática de enzimas productoras de formaldehído, como los citocromos P450. La exclusividad de este kit se basa en el hecho de que el sustrato fluorescente no interviene en la reacción multicomponente del P450, sino que mide el producto de la desmetilación: el formaldehído. No se requiere separación ni lavado. El kit se ha validado para su uso en varios sistemas P450 y funciona con cualquier sistema biológico que produzca formaldehído derivado de la desmetilación.

El kit proporciona un tampón optimizado para P450, viales liofilizados del cofactor NADPH para la reacción, un estándar estable de formaldehído, el reactivo de detección de formaldehído (FDR) y dos placas de 96 pocillos para la detección de la señal fluorescente generada. El usuario final tendrá que proporcionar el sistema de microsomas, baculosomas o el sistema recombinante de P450, reductasa y citocromo b5, además de los cofactores necesarios para la actividad, junto con los fármacos, inhibidores o activadores que se estén probando. La reacción debe realizarse en el tampón suministrado o en un sistema de tampón similar basado en PBS.

Una vez se produzca la reacción inducida por el NADPH P450, la generación de formaldehído se puede detener añadiendo un inhibidor adecuado o la solución de interrupción de ácido acético suministrada. A continuación, se añade el FDR a todos los pocillos. Si es necesario calibrar el formaldehído (para comparaciones entre laboratorios), se debe obtener una curva estándar de formaldehído generada a partir del estándar suministrado.

Tras una breve incubación a 37 °C durante 30 minutos, el producto fluorescente se lee a 510 nm en un lector de placas fluorescentes con excitación a 450 nm. La actividad de P450 se determina en base a la producción de formaldehído.