Efecto de las propiedades del líquido en el pipeteo

Las pipetas que se emplean en los laboratorios hoy en día suelen ajustarse para suministrar un volumen deseado utilizando agua. Los expertos aceptan el agua como líquido de referencia, ya que se conocen perfectamente sus propiedades físicas en diferentes condiciones ambientales. Sin embargo, en un entorno real de laboratorio, la transferencia de líquidos siempre se ve influida por una combinación de numerosos factores. Las propiedades del líquido forman parte de dichos factores y pueden tener un efecto considerable en los volúmenes dispensados. A continuación se analiza la influencia de varias propiedades diferentes.

Explicaciones de conceptos

Calibración: determinación de la diferencia entre el volumen medio de la serie de mediciones y el volumen seleccionado en la pantalla de la pipeta.
Ajuste: modificación de los ajustes de la pipeta para que el volumen real se corresponda con el volumen seleccionado.
CV%: coeficiente de variación, un valor relativo obtenido a partir de la desviación estándar estadística y el valor medio de las mediciones.

Propiedades de los líquidos que influyen en los resultados del pipeteo

La mayoría de las pipetas que se utilizan en los laboratorios se basan en el principio del pistón de aire. Esto significa que hay un espacio de aire entre el líquido y el pistón. La mayor parte de los líquidos se pueden transferir de forma más precisa con una pipeta de pistón de aire que con una pipeta de desplazamiento positivo (basada en el contacto directo entre el líquido y el pistón). No obstante, algunas características de los líquidos y factores ambientales pueden provocar desviaciones en el suministro de líquido. La diferencia de comportamiento se debe al espacio de aire existente, circunstancia que debe tenerse en cuenta al utilizar las pipetas.

Los diferentes enfoques teóricos y empíricos que explican las influencias observadas se han analizado en el material de apoyo al usuario final proporcionado por diversos fabricantes de pipetas. Pese a ello, puede resultar difícil aplicar las teorías científicas a situaciones prácticas.

La transferencia real de líquido siempre está influida por una combinación de diversos factores, entre los que se incluyen las propiedades de los líquidos. Por este motivo, valorar un caso concreto puede suponer un desafío. A continuación se explican varios factores individuales que ofrecerán cierto contexto, de forma que el efecto combinado se comprenda mejor.

Densidad del líquido

Con las pipetas de pistón de aire, el espacio de aire que hay entre el líquido y el pistón actúa de forma similar a un muelle. Esto significa que, cuando una pipeta se ajusta para suministrar un volumen exacto de agua, dicha pipeta proporciona un volumen mayor de un líquido de menor densidad. Esto se debe a que el mismo volumen que se obtuvo con el agua es más ligero con el líquido menos denso. El espacio de aire (muelle) no está equilibrado con este volumen, de modo que aspira el líquido un poco más que cuando se trata de agua. Con un líquido más denso, se obtiene el efecto inverso. La mayor densidad impone una fuerza superior en el espacio de aire, lo que provoca que se estire y, por lo tanto, se aspire menos volumen de líquido hacia la punta.

El efecto de la densidad puede reducirse transfiriendo una cantidad diferente de líquido. No se recomienda ajustar el suministro de volumen para que la configuración de la pantalla se corresponda con otros líquidos que no sean agua. El motivo es que las pipetas se utilizan para dispensar varios líquidos diferentes, cada uno con sus propiedades específicas. Es más fiable utilizar un líquido de referencia como el agua para controlar el rendimiento de la pipeta. El efecto de otros líquidos se puede evaluar realizando una calibración y cambiando el volumen suministrado en consecuencia (es decir, si el resultado de la calibración ofrece un volumen 5 µl menor en el ajuste de 500 µl, la corrección se puede aplicar estableciendo el volumen de suministro a 505 µl para compensar la diferencia).

Siempre hay otros factores que se combinan con el efecto de la densidad, de modo que es difícil ofrecer buenos ejemplos. Uno de ellos podría ser las soluciones de sales inorgánicas. Con un ajuste de 1000 μl, la pipeta proporciona valores de volumen aproximadamente 1 μl menores al pipetear una solución saturada de NaCl y agua en comparación con el agua pura. Una solución salina diferente puede dar otros resultados. En la figura 1 se muestran los resultados obtenidos a partir de dos soluciones salinas (solución saturada de NaCl y solución de Na₂CO₃ al 20 % en peso) en comparación con agua pura. Se utilizó una punta estándar FT 1000.

Presión de vapor y evaporación

Todos los líquidos presentan un equilibrio entre los estados líquido y gaseoso. Para alcanzar dicho equilibrio, el líquido se evapora hasta que se genera una concentración determinada en la atmósfera circundante. La presión de vapor es una propiedad de los líquidos que describe la rapidez con la que estos tienden a alcanzar el punto de equilibrio. Los líquidos con una gran presión de vapor comienzan a evaporarse en el espacio de aire de la punta cuando el líquido se aspira hacia ella. El espacio de aire se expande debido al líquido evaporado y, dado que hay otra forma de aliviar la presión, el líquido comienza a salir por el orificio de la punta. A menudo esto se considera erróneamente como una fuga, cuando en realidad se trata de un fenómeno natural. Las primeras dosis de una serie de pipeteo también ofrecen volúmenes más pequeños, ya que la expansión de la fase gaseosa evita que parte del líquido entre en la punta.

La evaporación es un fenómeno continuo. Por ello, es importante recordar que los líquidos volátiles también se evaporan durante la dispensación. El volumen que entra en el recipiente objetivo es menor que la cantidad que había en la punta antes de dispensar. Esto puede ser notorio especialmente con volúmenes pequeños.

Para reducir los efectos de la evaporación, se recomienda humedecer la punta previamente. Aspirar y dispensar el líquido un par de veces acerca el espacio de aire al punto de equilibrio. Durante la serie de dosificación real después del humedecimiento previo, la diferencia entre las dosis es menor y el fenómeno de «fuga» es insignificante.

Cabe destacar que algunos líquidos, como los alcoholes, poseen el denominado «efecto limpiaparabrisas». La grasa lubricante de la pipeta puede eliminarse de las superficies de deslizamiento tras varios pipeteos, con lo que el pistón empieza a atascarse. Para solucionarlo, se puede mover el émbolo unas cuantas veces sin el líquido para que la grasa vuelva a diseminarse.

Viscosidad

La viscosidad es una propiedad que limita el movimiento. Por lo tanto, un líquido con una alta viscosidad (por ejemplo, el glicerol) fluye dentro y fuera de la punta muy lentamente. Si la punta se retira del depósito de líquido demasiado pronto, también se le introduce una burbuja de aire, lo que reduce el volumen de líquido.

Durante la dispensación, los líquidos viscosos dejan una película en las paredes de la punta y la película se desliza hacia abajo más lentamente que la mayor parte de la masa líquida. Si se presiona el émbolo demasiado rápido, parte del líquido se queda en la punta debido a la mencionada lentitud de movimiento. Los resultados se pueden mejorar disminuyendo la velocidad de pipeteo. Una aspiración lenta permite que el líquido alcance un nivel de equilibro y una dispensación lenta reduce el efecto de la película de retención de líquidos. Asimismo, resulta útil emplear la técnica del pipeteo inverso, que también reduce el efecto de la retención de líquidos. El uso de puntas de orificio ancho facilita la aspiración y dispensación del líquido y permite que este se mueva con mayor libertad por el orificio de la punta.

En la figura 3 se muestra el efecto de la técnica de pipeteo utilizada en los resultados con glicerol. Las curvas son los valores medios de tres series de mediciones individuales realizadas con cada una de las técnicas. Se han tenido en cuenta las precauciones mencionadas anteriormente. Los valores de %CV individuales oscilaron entre el 0,69 % y el 1,15 % con el método directo y entre el 0,27 % y el 0,50 % con el método inverso. El uso del método inverso reduce la desviación de los resultados, pero también aumenta el volumen debido a una columna de líquido más alta. La pipeta se ajustó para glicerol utilizando el método directo.

Figura 3.La evaporación hace que el líquido salga por el orificio de la punta si esta no se ha humedecido previamente. A la derecha, una punta seca y, a la izquierda, una punta previamente humedecida con una solución de etanol con color 15 s después de la aspiración.

Tensión superficial

La tensión superficial describe la intensidad de las fuerzas intermoleculares que mantienen unida la masa del líquido. Un buen ejemplo de un líquido con una elevada tensión superficial es el agua. Los tensoactivos como el Tween se utilizan en varias aplicaciones de laboratorio actuales, como los inmunoensayos en microplacas. Los aditivos utilizados reducen la tensión superficial del medio, lo que, por ejemplo, mejora la especificidad del análisis.

Como los tensoactivos reducen la tensión superficial, la capacidad humectante del líquido cambia. Una película muy fina de líquido permanece en las paredes de la punta y fluye hacia abajo más lentamente que la mayor parte de la masa del líquido. El efecto se asemeja al comportamiento de los líquidos viscosos, pero la película líquida restante es mucho más fina. Con líquidos incoloros, a veces la película es indetectable. Tras el movimiento de dispensación, es posible que todavía quede algo de líquido en la punta.

Los aditivos también pueden provocar cierta tendencia a la formación de espuma en los líquidos. En consecuencia, parte del líquido puede quedar atrapado en la espuma y permanecer en la punta tras la dispensación. Esto se debe a que el volumen combinado del líquido y la espuma suele ser mayor que el volumen del movimiento de dispensación. La espuma también puede causar alteraciones no deseadas en otros procedimientos de aplicación (por ejemplo, en las mediciones fotométricas).

El efecto de la reducción de la tensión superficial se puede mitigar disminuyendo la velocidad de pipeteo. Asimismo, el efecto de la retención del líquido se puede reducir utilizando la técnica de pipeteo inverso.

Análisis

Las propiedades físicas de los líquidos pueden causar desviaciones notables en los procesos de manipulación de líquidos si no se tienen en cuenta. Dichas propiedades provocan diferentes comportamientos en la dosificación de los líquidos, dependiendo de la situación. Se pueden reducir los efectos observados cambiando, por ejemplo, la velocidad y la técnica de pipeteo. Sin embargo, hay que tener en cuenta que las propiedades de los líquidos no son los únicos factores de influencia, sino que, más bien, el resultado es siempre una combinación de diversos fenómenos. Por lo tanto, para confirmar el efecto real, es necesario realizar una calibración.

Referencias:

1) Koivisto, S., The Tip of Perfection, Factors Affecting Pipetting Performance, Laboratory Equipment 8
(2007) 38-40.

2) International standard, EN ISO 8655 Piston-operated volumetric apparatus, ISO, Geneva 2002.

Contenido facilitado por:

Descubra más acerca de los productos de Thermo Scientific