Geles de electroforesis de acrilamida

En la electroforesis en gel, el acrilamida se utiliza para formar un gel de poliacrilamida, que sirve como una matriz a través de la cual las moléculas como proteínas o ácidos nucleicos pueden separarse según su tamaño y carga. Aquí están los roles y funciones clave del acrilamida en la electroforesis en gel:

Formación del gel

El acrilamida, en combinación con un agente de reticulación (generalmente N,N'-metilenbisacrilamida), sufre una reacción de polimerización para formar un gel de poliacrilamida. Este gel consiste en una red de largas cadenas de polímero reticuladas entre sí, creando una estructura porosa.

Control del tamaño de los poros

La concentración de acrilamida y la proporción de acrilamida a bisacrilamida determinan el tamaño de los poros del gel. Las concentraciones más altas de acrilamida crean poros más pequeños, lo que proporciona una mayor resolución para la separación de moléculas más pequeñas. Por el contrario, las concentraciones más bajas crean poros más grandes, adecuados para la separación de moléculas más grandes. Las concentraciones típicas de acrilamida varían de 3-20%, con porcentajes más bajos utilizados para moléculas más grandes y porcentajes más altos para moléculas más pequeñas.

Resolución y separación

El gel de poliacrilamida actúa como un tamiz molecular. Las moléculas más pequeñas se mueven más fácilmente a través de los poros y, por lo tanto, migran más rápido, mientras que las moléculas más grandes se ven obstaculizadas y migran más lentamente. Esta migración dependiente del tamaño permite la separación de moléculas según su tamaño.

En la electroforesis de proteínas, como SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio), las proteínas se desnaturalizan y se recubren con SDS, lo que les da una carga negativa uniforme. El gel de poliacrilamida luego separa las proteínas principalmente por tamaño.

Estabilidad y versatilidad

Los geles de poliacrilamida son químicamente estables y pueden utilizarse para una variedad de técnicas electroforéticas, incluyendo PAGE nativa (donde las proteínas no se desnaturalizan) y PAGE desnaturalizante (como SDS-PAGE). Los geles pueden fundirse en varias espesuras y formatos, incluyendo geles de placa y geles de tubo, dependiendo de los requisitos experimentales.

La electroforesis en gel de agarosa y la electroforesis en gel de acrilamida son dos técnicas comunes utilizadas para separar moléculas, típicamente ácidos nucleicos y proteínas, basándose en su tamaño y carga. Las principales diferencias entre las dos son:

Composición del gel

La electroforesis en gel de agarosa utiliza agarosa, un polisacárido extraído de algas marinas. El gel se forma disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón y permitiendo que se enfríe y solidifique. La electroforesis en gel de acrilamida utiliza poliacrilamida, formada por la polimerización de monómeros de acrilamida con un agente reticulante (generalmente bisacrilamida). El proceso de polimerización se inicia químicamente.

Tamaño de los poros

La agarosa tiene poros relativamente grandes, lo que la hace adecuada para separar moléculas más grandes, como fragmentos de ADN (típicamente de 100 pb a varios kb). La acrilamida tiene poros más pequeños y uniformes, que son adecuados para separar moléculas más pequeñas, como proteínas y pequeños ácidos nucleicos (típicamente de 5 pb a 1 kb).

Resolución

La agarosa proporciona una resolución más baja debido al tamaño más grande de los poros, ideal para separar grandes fragmentos de ADN, pero menos efectiva para fragmentos pequeños o proteínas. La acrilamida proporciona una resolución más alta debido al tamaño más pequeño de los poros, lo que la hace ideal para distinguir entre proteínas o pequeños fragmentos de ácidos nucleicos con pequeñas diferencias de tamaño.

Aplicaciones

La agarosa se usa comúnmente para la electroforesis de ADN y ARN, especialmente para análisis de rutina, como verificar el tamaño de los productos de PCR, digestiones de restricción y la integridad del ARN. La acrilamida se usa comúnmente para la electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) y geles de secuenciación de ADN de alta resolución, así como para separar pequeños fragmentos de ácidos nucleicos.

Preparación y manipulación

La agarosa es más fácil y segura de preparar, ya que no implica productos químicos tóxicos. Simplemente disolver en tampón, calentar y verter en un molde. La acrilamida es más compleja y requiere una manipulación cuidadosa debido a la toxicidad de los monómeros de acrilamida. La polimerización debe controlarse cuidadosamente, generalmente con la adición de TEMED y persulfato de amonio.

Tampón de corrida

La agarosa a menudo utiliza tampón TAE (Tris-acetato-EDTA) o TBE (Tris-borato-EDTA). La acrilamida típicamente utiliza tampón Tris-Glicina-SDS para la electroforesis de proteínas (SDS-PAGE).